Главная / Лекарственный мониторинг / Тест Циклоспорин ПЛЮС CEDIA®

Тест Циклоспорин ПЛЮС CEDIA®

Тест «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA®» microgenics

№ по каталогу: 100147 Для диагностики in vitro

Предназначение

Тест «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA®» предназначен для количественного определения in vitro содержания циклоспорина в цельной крови человека с помощью автоматических биохимических анализаторов в качестве вспомогательного средства ведения терапии циклоспорином при трансплантации почек, печени и сердца.

Резюме и разъяснение теста

Циклоспорин – это гидрофобный циклический ундекапептид грибкового происхождения, обладающий свойствами иммунодепрессанта.^1-2Хотя механизм его действия по-прежнему изучается, циклоспорин, по всей вероятности, воздействует на метаболизм Т-H лимфоцитов и Т-S лимфоцитов, ослабляя иммунную систему.^3-5В силу своих иммуннодепрессантных свойств циклоспорин является очень эффективным лекарственным препаратом для лечения некоторых аутоиммунных заболеваний и снижения риска отторжения тканей после пересадки органов. Безопасность и эффективность терапии оптимальны при очень низком диапазоне концентраций циклоспорина, который может вызвать ряд побочных эффектов.^{6, 7} Наиболее критичными побочными эффектами являются отторжение органа вследствие неадекватности дозы, а также нефротоксичность и гепатотоксичность, вероятность которых повышается с увеличением концентрации лекарства.^8-11

Циклоспорин вводят внутрь или внутривенно. Так как абсорбция лекарства и его метаболизм в печени очень индивидуальны, корреляция между его уровнем в крови и введенной дозой практически отсутствует.¹² Концентрации циклоспорина в крови зависит от таких факторов, как природа трансплантата, возраст и общее состояние здоровья пациента, одновременное введение таких препаратов, как карбамазепин, фенитоин, фенобарбитал, эритромицин, рифампин, циметидин и кетоконазол. ^13-17 Мониторинг циклоспорина необходим для достижения оптимального эффекта подавления иммунитета у больных при пересадке органов. ^18-20

Измерение концентраций циклоспорина в цельной крови в совокупности с другими лабораторными и клиническими результатами – это лучший подход для оптимизации иммунодепрессии и минимизации побочных эффектов у пациентов после пересадки органов.

В тесте «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA®» применена технология рекомбинатной ДНК (Патент США №4708929) для получения уникальной системы гомогенного иммуноферментного анализа.²¹. В основе теста лежит бактериальный фермент b-галактозидаза, который с помощью генной инженерии был разделен на два неактивных фрагмента (части). Эти фрагменты спонтанно связываются вновь, образуя действующие в полную силу ферменты, которые в формате теста расщепляют субстрат, что приводит к изменению цвета, которое можно измерить методом спектрофотометрии.

В тесте анализируемое вещество в образце конкурирует с анализируемым веществом, сопряженным с одним неактивным фрагментом b-галактозидазы, за место связывания антитела. Если в образце присутствует анализируемое вещество, оно связывается с антителом, при этом неактивные фрагменты фермента свободно образуют активные ферменты. Если в образце анализируемого вещества нет, антитело связывается с анализируемым веществом, сопряженным с неактивным фрагментом, подавляя повторное соединение неактивных фрагментов b-галактозидазы, при этом не происходит образования активного фермента. Количество образованного активного фермента и вызванное этим изменение абсорбции прямо пропорциональны содержанию анализируемого вещества в образце.

Реагенты

1 EA буферный растворитель: содержит MOPS [3-(N-морфолино) пропан-сульфонокислый буфер], 0,50 мкг/мл моноклональные антитела мыши к циклоспорину, стабилизатор и консервант, 1 х 41 мл

1а EA реагент: содержит 0,171 г/л акцепторной части фермента (микробного), буферные соли и консервант, 1 х 41 мл

2 ED буферный растворитель: содержит MES [2-(N-морфолино) этан-сульфонокислый буфер], детергент и консервант, 1 х 19 мл

2а ED реагент: содержит 52 мкг/л донорской части фермента (микробного), сопряженной с циклоспорином, 2,73 г/л хлорфенол красный-b-D-галакторинанозид, стабилизаторы и консервант, 1 х 19 мл

3 Лизирующий реагент: содержит буферные соли, детергенты и консервант, 1 х 98 мл

4 Калибратор А низкого диапазона: содержит 0,45 г BSA и 0,063 мкг циклоспорина А

5 Калибратор B низкого диапазона: содержит 0,45 г BSA и 1,125 мкг циклоспорина А

Дополнительные материалы: штрих-коды Hitachi для количественного определения высокого диапазона, штрих-коды 1 R1 и R2. Пустая бутыль анализатора объемом 50 мл.

Требуемые дополнительные материалы, не входящие в комплект поставки:

№ по каталогу 100012 Калибровочный комплект высокого диапазона «CEDIA Циклоспорин ПЛЮС»

№ по каталогу 100207 Стандарт высокого диапазона циклоспорина, уровень 4

№ по каталогу 100208 Стандарт высокого диапазона циклоспорина, уровень 5

Автоматический биохимический анализатор

Имеющиеся в продаже контрольные материалы. Обратитесь в Службу технической поддержки компании Microgenics, чтобы получить рекомендации относительно подходящих контрольных материалов.

Меры предосторожности и предупреждения

Используйте обычные меры предосторожности, применяемые при работе с любыми лабораторными реагентами. Реагенты содержат азид натрия в концентрации ниже 0.15%. Избегайте попадания реагентов на кожу и слизистые оболочки. В случае попадания подвергшиеся воздействию участки следует промыть большим количеством воды. В случае попадания в глаза или при проглатывании необходимо немедленно обратиться к врачу. Азид натрия может вступить в реакцию с цинковой или медной сантехникой, образуя потенциально взрывоопасные азиды металлов. При утилизации таких реагентов всегда смывайте их большими количествами воды, чтобы предотвратить накопление азидов. Очищайте открытые металлические поверхности 10% гидроксидом натрия.

Приготовление и хранение реагентов

См. ниже процедуру приготовления растворов для анализаторов фирмы Hitachi. Для всех других анализаторов смотрите инструкции по применению конкретного анализатора. Приготовьте следующие растворы, используя холодные реагенты и буферные растворы. Вынимайте набор из холодильника (2-8°С) непосредственно перед приготовлением рабочих растворов.

Чтобы минимизировать возможное загрязнение, готовьте растворы в следующем порядке.

Раствор донорской части фермента R2: Соединить бутыль 2а (реагент ED) и бутыль 2 (буферный растворитель) с помощью одного из входящих в комплект переходников. Смешать содержимое, мягко переворачивая сосуды так, чтобы весь сублимат из бутыли 2а оказался в бутыли 2, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить бутыль 2а и переходник от бутыли 2 и выбросить их. Закрыть бутылку 2 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при комнатной температуре (15-25°С). Снова мягко перемешать содержимое. Написать на этикетке бутылки дату разведения. Поставить бутыль непосредственно в отсек анализатора, предназначенный для реагентов, или в холодильник (2-8°С) и дать постоять 15 минут перед использованием.

Раствор акцепторной части фермента R1: Соединить бутыль 1а (реагент EA) и бутыль 1 объемом 70 мл (буферный растворитель EA) с помощью одного из входящих в комплект переходников. Смешать содержимое, мягко переворачивая сосуды так, чтобы весь сублимат из бутыли 1а оказался в бутыли 1, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить бутыль 1а от переходника. Выбросить бутыль 1. Если в Вашем анализаторе используются 70-мл бутыли этого типа, переходите к следующему параграфу. Если в Вашем анализаторе используются 50-мл бутыли для раствора R1, нужно присоединить 50-мл бутыль 1 к 70-мл бутыли 1 с помощью того же самого переходника и дать содержимому из 70-мл бутыли 1 полностью перетечь в 50-мл бутыль 1, затем отсоединить 70-мл бутыль 1 и переходник и выбросить их.

Закрыть бутыль 1 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при комнатной температуре (15-25°С). Снова мягко перемешать содержимое. Написать на этикетке бутыли дату разведения. Поставить бутыль непосредственно в отсек анализатора, предназначенный для реагентов, или в холодильник (2-8°С) и дать постоять 15 минут перед использованием.

Лизирующий реагент: Лизирующий реагент – это жидкость, и ее не нужно разводить. Мягко перемешать содержимое бутыли перед каждым использованием, перевернув бутыль 2-3 раза. Записать на этикетке дату, когда бутыль с лизирующим реагентом была открыта. Снять крышку и налить требуемое количество лизирующего реагента в пробирку с образцом, как указано в соответствующих инструкциях по применению теста «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA®».

Применение штрих-кода: Штрих-коды на бутылях с реагентами предназначены для анализа низкого диапазона. Для анализа высокого диапазона используйте прилагаемые штрих-коды.

ПРИМЕЧАНИЕ 1: Входящие в этот набор компоненты предназначены для использования в комплекте. Не смешивайте компоненты из разных наборов.

ПРИМЕЧАНИЕ 2: Избегайте перекрестного загрязнения реагентов, следя за тем, чтобы крышки от бутылей с реагентами совпадали с нужной бутылью. Раствор R2 (донорской части фермента) должен быть желто-оранжевого цвета. Красный или пурпурно-красный цвет говорит о загрязнении реагента, и в таком случае его следует вылить.

ПРИМЕЧАНИЕ 3: Растворы R1 и R2 до анализа должны находиться при температуре отсека анализатора для реагентов. См. дополнительно в инструкции по применению конкретного анализатора.

ПРИМЕЧАНИЕ 4: Готовьте раствор R2 раньше раствора R1.

ПРИМЕЧАНИЕ 5: Для обеспечения стабильности восстановленного реагента EA, его следует защищать от продолжительного непрерывного воздействия яркого света.

Храните реагенты при температуре 2-8°С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ ИХ. Относительно стабильности неоткрытых компонентов см. срок годности на коробке или ярлыках бутылей.

Раствор R1: 60 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.

Раствор R2: 60 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С

Лизирующий раствор: 60 дней при температуре 2-8°С.

Калибраторы: 60 дней при температуре 2-8°С

Сбор и обработка образцов

Используйте цельную кровь, обработанную ЭДТА.²² Необходимо принять меры по обеспечению целостности образца со времени сбора до времени анализа. Образцы следует помечать с указанием времени сбора крови и времени последнего введения лекарства. Образцы должны храниться закрытыми при температуре 2-8°С, если анализ проводится в течение 7 дней после сбора, или при температуре -20°С, если анализ проводится в течение 1 месяца. Избегайте повторного замораживания и оттаивания. Избегайте пенообразования у образцов.

Приготовление образца

Дайте время, чтобы калибраторы, стандарты и образцы от пациентов нагрелись до комнатной температуры.
Перед использованием перемешайте образец (калибраторы, стандарты или образец пациента) мягко, но тщательно.
С помощью пипетки отберите точно 100 мкл образца в пробирку для образца.
С помощью пипетки добавьте ровно 400 мкл лизирующего раствора набора «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» в каждую пробирку с образцом.
Тщательно встряхните на вортексе каждую пробирку в течение 2-5 секунд.
Поместите пробирки с образцами в прибор и проведите анализ.

Гемолизат стабилен в течение 1,5 часов при температуре 15-25°С в пробирке с образцом. ²³

Примечание: Анализаторы Hitachi 911, 912 и 917

Если анализатор не читает штрих-код, числовую последовательность на этикетке со штрих-кодом можно ввести вручную с помощью клавиатуры.

Тестовый набор «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» предназначен для применения на автоматических биохимических анализаторах. Конкретные рабочие характеристики находятся в файле корпорации Microgenicx.²³

Процедура анализа

На дисках с параметрами есть параметры приборов Hitachi 911, 912 и 917. Чтобы получить дополнительные диски или параметры анализаторов Beckman Synchron, Olympus и других анализаторов, обратитесь в Службу технической поддержки компании Microgenics.

Калибровка

Тест «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» использует линейную калибровочную кривую, полученную с помощью соответствующих калибраторов, входящих в набор «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA». С помощью программы анализатора можно обработать данные методом линейной регрессии наименьших квадратов. Проверяйте калибровку с помощью имеющихся в продаже стандартов (-а) с установленными диапазонами данных для теста «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA».

ПРИМЕЧАНИЕ: В каждый калибровочный комплект включены листы со значениями калибратора. Перед использованием нового калибровочного комплекта проверьте Ваши химические параметры, чтобы убедиться, что концентрации калибратора соответствуют значениям на карточке.

Регулярность калибровки

Рекомендуется проводить повторную калибровку

- После смены бутыли с реагентом

- После смены калибратора или набора реагентов

- После проведения ежемесячного технического обслуживания прибора

- Согласно требованиям процедур контроля качества

Диапазон анализа

Диапазон анализа для низкого содержания – от 25 нг/мл до 450 нг/мл. Минимальная определяемая концентрация теста «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» - 25 нг/мл.

Диапазон анализа для высокого содержания – от 450 нг/мл до 2000 нг/мл.

Образцы, выходящие за пределы диапазона

Количественное содержание в образцах, превышающее диапазон калибратора высокого содержания «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA», может быть показано как >2000 нг/мл, или же можно развести одну часть исходного образца одной частью цельной крови без циклоспорина, провести лизирование и повторный анализ.

Перед использованием перемешайте образец мягко, но тщательно.

Добавьте точно 50 мл образца пациента и точно 50 мл цельной крови без циклоспорина в чашку с образцом.
С помощью пипетки добавьте в каждую пробирку с образцом точно 400 мкл лизирующего реагента «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA».
Тщательно встряхните каждую пробирку в течение 2-5 секунд.
Поместите пробирку (-и) с образом в прибор и проведите повторный анализ.

Полученное при повторном анализе значение следует выводить следующим образом:

Фактическое значение = 2 х значение разведенного образца

Результаты образцов, значения которых находятся ниже минимальной определяемой концентрации, выглядят следующим образом: < 25 нг/мл.

Контроль качества и калибровка

Каждая лаборатория должна установить свою собственную регулярность проверки.

Рекомендации по хорошей лабораторной практике предполагают проведение контроля качества не менее чем у двух уровней (низкие и высокие значения) каждый день, когда анализируются образцы пациентов, каждый раз с проведением калибровки. Отслеживайте контрольные значения на предмет каких-либо тенденций или сдвигов. В случае обнаружения каких-либо тенденций или сдвигов, или если результаты стандарта не отвечают указанному диапазону, необходимо проверить все рабочие параметры. Свяжитесь со Службой технической поддержки компании Microgenics за дополнительной помощью и рекомендациями относительно подходящего контрольного материала.

ПРИМЕЧАНИЕ: Проводите повторную оценку контрольных значений и диапазонов после смены партии реагента.

Результаты и ожидаемые значения

См. подробную информацию о расчете в соответствующем руководстве для оператора или протоколе конкретного прибора.

Ограничения²³

Характеристики теста «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» определялись только для цельной крови человека, обработанной ЭДТА, но не для каких-либо других жидкостей тела.

Критерий: Выход ±15 нг/мл исходного значения при концентрациях < 150 нг/мл или ±10% исходного значения при концентрациях > 150 нг/мл.

Желтуха: Не оказывает существенного влияния до значения индекса I, равного 60 (концентрация несвязанного билирубина около 60 мг/дл)

Липемия: Не оказывает существенного влияния при значениях триглицеридов до 1000 мг/дл. Не оказывает существенного влияния при значениях холестерина до 300 мг/дл. Высокие уровни триглицеридов и холестерина могут привести к заниженной количественной оценке.

Общий белок: < 10 г/дл влияния не оказывает. Высокие уровни белка могут привести к заниженной количественной оценке.

Ревматоидный фактор: < 100 МЕ/мл влияния не оказывает.

Диапазон гематокрита: от 30,5% до 53,5%. Более высокие уровни гематокрита могут привести к заниженной количественной оценке. У больных, у которых возможно накопление метаболитов, например, с нарушенной печеночной функцией, неожиданно высокие значения лекарства или увеличенное время выведения лекарства, применение этого теста можно подтвердить методом, обладающим высокой специфичностью к исходному соединению, например, с помощью ВЭЖХ.

Число пациентов, у которых могут быть антитела к b-галактозидазе E. coli, чрезвычайно мало. Однако образцы, содержащие такие антитела, могут показать неестественно высокие результаты, не соответствующие клиническому профилю. В таком случае обратитесь за помощью в Службу технической поддержки компании Microgenics.

Так как в тесте используются антитела мыши, существует вероятность интерференции противомышиных антител человека (HAMA) в образце, что может привести к ложно повышенным результатам. Необходимо следить за тем, чтобы образцы крови отбирались через одинаковые промежутки времени после введения циклоспорина.

Ожидаемые значения

Нет твердо установленного терапевтического диапазона содержания циклоспорина в цельной крови. Тяжесть клинического состояния, индивидуальные различия в чувствительности к иммунодепрессивному и нефротоксическому действию циклоспорина, одновременное введение других иммунодепрессантов, тип транспланта, время после трансплантации, а также ряд других факторов будут определять разные требования к оптимальным уровням циклоспорина в крови. Взятые сами по себе значения циклоспорина нельзя использовать в качестве единственного показания для изменения схемы лечения. До проведения корректировки лечения каждый пациент должен подвергаться тщательной клинической оценке, и для каждого пациента следует устанавливать его или ее диапазоны, основываясь на клиническом опыте.²⁴ Диапазоны будут меняться при использовании разных имеющихся в продаже тестов. Нельзя прогнозировать значения для конкретных больных, используя коэффициенты перерасчета. Рекомендуется для каждого пациента все время использовать одинаковый тест из-за различной перекрестной реактивности метаболитов.

Конкретные рабочие характеристики²³

Ниже показаны типичные данные, получаемые на анализаторе Hitachi 911. Результаты, получаемые в Вашей лаборатории, могут от них отличаться. См. дополнительно конкретные рабочие характеристики конкретного анализатора в протоколе к конкретному анализатору.

Точность

При измерениях точности с использованием упакованных реагентов, смешанной цельной крови и контрольных образов цельной крови были получены следующие результаты, выраженные в нг/мл: анализатор Hitachi 911 (37°С) NCCLS, модифицированный эксперимент с повторением одинаковых испытаний, EP5-T (по 3 одинаковых испытания каждый день в течение 21 дня).

Количественное определение в низком диапазоне			В пределах прогона		Всего
Образец	n	x	SD	CV%	SD	CV%
Bio-Rad CI	63	46.2	3.7	8.0	7.4	16.0
Bio-Rad CII	63	199.7	5.9	2.9	9.1	4.6
LowPool	63	54	4.7	8.8	6.6	12.2
HighPool	63	434.7	6.7	1.6	19.4	4.5

Количественное определение в высоком диапазоне			В пределах прогона		Всего
Образец	n	x	SD	CV%	SD	CV%
CIII	63	418	31.7	7.6	40.5	9.6
CIV	63	642	38	5.9	47.0	7.3
CV	63	1251	49.9	4.0	63.9	5.1
LowPool	63	472	22.8	4.8	35.1	7.5
HighPool	63	1695	39.2	2.3	87.3	5.2

Сравнение метода – Количественное определение в низком диапазоне

Сравнение результатов, полученных с помощью теста «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» компании Microgenics, (y), с результатами ВЭЖХ-MS (x) в четырех точках дало следующую корреляцию.

Сравнение метода «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» в низком диапазоне определения (все типы трансплантов)

Liver = Печень

Kidney - Почка

Heart Lung – Сердце Легкое

Количественное определение в низком диапазоне с помощью «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA»

Сравнение результатов, полученных с помощью теста «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» компании Microgenics, (y), с результатами ФПИА (x), EMIT® (x) и ВЭЖХ-MS (x) в четырех точках дало следующие корреляции.

Популяция при сравнении метода в ходе количественного определения в низком диапазоне по сравнению с результатами ВЭЖХ-MS: 311 образцов, взятых у 228 больных при минимальных уровнях препарата в крови, которые представляют: возраст от 18 до 77 лет, транспланты: 107 острых, 195 хронических, 109 сердце-легкие, 80 печень и 122 почка.

Сравнение метода – Количественное определение в высоком диапазоне

Сравнение метода «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» в высоком диапазоне определения (все типы трансплантов)

Kidney - Почка

Liver = Печень

Количественное определение в высоком диапазоне с помощью «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA»

Популяция при сравнении метода в ходе количественного определения в высоком диапазоне по сравнению с результатами ВЭЖХ-MS: 93 образца, взятых у 21 больного в течение 8 часов после введения циклоспорина, которые представляют: возраст от 30 до 72 лет, транспланты: 83 острых, 8 хронических, 46 печень и 47 почка.

Линейность

Для оценки линейности при количественном определении в низком диапазоне смешанный образец крови больных с высоким содержанием циклоспорина был разведен цельной кровью без лекарства; при количественном определении в высоком диапазоне для разведения использовался смешанный образец крови пациентов с содержанием циклоспорина. После чего определялся процент выхода путем деления полученного значения на ожидаемое значение. Ожидаемые значения генерировались на основе идущего вниз наклона кривой и отрезка регрессии полученных тестовых значений.

	Количественное определение в низком диапазоне			Количественное определение в высоком диапазоне
% Образца с высоким содержанием	Ожидаемое значение (нг/мл)	Полученное значение (нг/мл)	% выхода	Ожидаемое значение (нг/мл)	Полученное значение (нг/мл)	% выхода
100	433	433	100	1930	1930	100
90	390	386	99.1	1782	1785	100.2
80	347	332	95.5	1633	1708	104.6
70	304	296	97.9	1485	1573	105.9
60	261	263	100.6	1337	1361	101.8
50	218	222	101.6	1189	1244	104.7
40	176	184	104.6	1040	1028	98.8
30	133	129	97	892	906	101.6
20	90	89	99.1	744	775	104.2
10	47	47	99.7	595	599	100.6
0	4	4	100	447	447	100

Выход

Для оценки выхода циклоспорин добавили к 21 образцу нормальной цельной крови. Для каждого набора из 21 образцов циклоспорин дал пики, показанные в таблице. Процент выхода определялся путем деления средней дозы каждого набора из 21 образцов с пиком на теоретическое количество циклоспорина, давшего пики в образцах.

Количественное определение в низком диапазоне			Количественное определение в высоком диапазоне
N	21	21	N	21	21
Ожидаемое значение, нг/мл	150	300	Ожидаемое значение, нг/мл	600	1600
х	141	308	х	590	1570
% выхода	94	103	% выхода	98	98

Специфичность

Были протестированы следующие соединения на перекрестную реактивность при количественном определении с помощью «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» путем выявления пиков in vitro в образцах цельной крови с примерным содержанием циклоспорина 200 нг/мл.

Чувствительность

Минимальная определяемая с помощью теста «Циклоспорин ПЛЮС CEDIA» концентрация – 25 нг/мл. Это значение было определено путем расчета концентрации циклоспорина, которая дала бы ответ, равный двум стандартным отклонениям от калибратора низкого диапазона. Функциональная чувствительность, которая является наименьшей концентрацией с коэффициентом вариации 20%при серии анализов, равна 40 нг/мл.