Тест Дигитоксин CEDIA®
Тест Дигитоксин CEDIA®
Для диагностики in vitro
Кат. № 100004 (17 комплектов х 13 мл)
Назначение
Тест Дигитоксин CEDIA® – это набор реагентов для диагностики in vitro, предназначенный для количественного определения содержания дигитоксина в сыворотке и в плазме человека.
Резюме и разъяснение теста
Дигитоксин – природный сердечный гликозид, используемый для лечения сердечной недостаточности и мерцательной аритмии. Основное фармакологическое действие дигитоксина - увеличение силы сокращений миокарда. Известно также, что дигитоксин замедляет желудочковый ритм при мерцательной аритмии.
По результатам исследований, до 23% от общего числа госпитализированных пациентов, получавших дигитоксин, в той или иной степени испытывали токсическое действие препарата, и уровень смертности среди этих пациентов более чем вдвое превышал уровень смертности среди пациентов, не испытывавших токсического действия. В то же время наблюдается высокая изменчивость индивидуальной восприимчивости в отношении эффективной и токсичной концентрации препарата.
Как и для большинства других препаратов, мониторинг концентрации дигитоксина в сыворотке должен сочетаться с другими клиническими данными, чтобы врач получал полную информацию для корректировки индивидуальной дозировки, достижения оптимального терапевтического эффекта и для предотвращения как концентрации препарата, не дающей терапевтического эффекта, так и вредной токсичной концентрации.
В тесте Дигитоксин CEDIA применена технология рекомбинатной ДНК (патент США №4708929) для получения уникальной системы гомогенного иммуноферментного анализа2.
В основе теста лежит бактериальный фермент b-галактозидаза, который с помощью генной инженерии был разделен на два неактивных фрагмента (части): акцептор фермента (АФ) и донор фермента (ДФ). Эти фрагменты спонтанно связываются вновь, образуя действующий фермент, который в формате теста расщепляет субстрат, что приводит к изменению цвета, которое можно измерить методом спектрофотометрии.
В ходе теста, дигитоксин в образце конкурирует за место связывания антитела с неактивным ДФ-фрагментом b-галактозидазы, сопряженным с дигитоксином. Если в образце присутствует дигитоксин, он связывается со специфическими антителами, при этом неактивные фрагменты ДФ свободно объединяются с фрагментами АФ, образуя активный фермент. Если в образце отсутствует дигитоксин, антитело связывается с неактивным ДФ-фрагментом, сопряженным с дигитоксином, подавляя повторное соединение фрагментов ДФ с фрагментами АФ, при этом не происходит образования активного фермента. Концентрация дигитоксина в образце прямо пропорциональна количеству образовавшегося активного фермента, которое определяется гидролизом хлорфенол красного-b-галактопиранозида.
Реагенты
1 Буферный растворитель АФ: Содержит буфер HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N-2-этансульфоновую кислоту), стабилизатор и консервант (17 мл).
1а Реагент АФ: Содержит акцептор фермента (0.28 г/л); антитела (овцы) к дигитоксину (8 мг/л).
2 Буферный растворитель ДФ: Содержит буфер HEPES.
2а Реагент ДФ: Содержит донор фермента, сопряженный с дигитоксином (3.12 мкг/л); CPR-b-D- галактопиранозид (2.21 г/л); ослиные антитела к антителам овцы (0.8 г/л).
3 Калибратор низкого диапазона: содержит обычную сыворотку человека (2 мл).
4 Калибратор высокого диапазона: содержит дигитоксин в обычной сыворотке человека (2 мл).
Меры предосторожности и предупреждения
Реагенты содержат азид натрия. Избегать попадания реагентов на кожу и слизистые оболочки. Промыть пораженные участки большим количеством воды. В случае попадания в глаза или при проглатывании немедленно обратиться к врачу. Азид натрия может вступать в реакцию со свинцовыми или медными водопроводными трубами, образуя взрывоопасные азиды металлов. При утилизации таких реагентов всегда смывать их большим количеством воды во избежание отложений азидов. Подверженные воздействию металлические поверхности очистить 10% гидроксидом натрия.
Материалы человеческого происхождения проверялись на инфекции ВИЧ 1 и 2, гепатит B и гепатит C, и результаты были отрицательными. Однако ни один метод не может полностью исключить потенциальный риск заражения с абсолютной уверенностью, поэтому с материалами следует обращаться с той же степенью осторожности, что и при обращении с образцами, взятыми у пациентов. Материалы могут быть потенциально заразными.
Приготовление и хранение реагентов
Вынимать комплект из холодильника следует непосредственно перед приготовлением растворов.
Приготовление растворов производите в следующем порядке, чтобы максимально уменьшить вероятность возможного загрязнения.
Раствор донора фермента R2: Соединить емкость 2а (реагент ДФ) с емкостью 2 (буферный растворитель ДФ) с помощью одного из прилагаемых переходников. Перемешать содержимое, осторожно переворачивая емкости так, чтобы весь лиофилизированный материал из емкости 2а оказался в емкости 2, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить от емкости 2 и выбросить емкость 2а с переходником. Закрыть емкость 2 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 10 минут при температуре 15-25°С. Снова осторожно перемешать содержимое и написать дату разведения на этикетке емкости. Перед применением поставить бутыль на 90 минут непосредственно в реагентный отсек анализатора или в холодильник и дать постоять.
Раствор акцептора фермента R1: Соединить емкость 1а (реагент АФ) с емкостью 1 (буферный растворитель АФ) с помощью одного из прилагаемых переходников. Перемешать содержимое, осторожно переворачивая емкости так, чтобы весь лиофилизированный материал из бутыли 1а оказался в бутыли 1, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить от емкости 1 и выбросить емкость 1а с переходником. Закрыть наполненную емкость 1 крышкой и оставить примерно на 10 минут при температуре 15-25°С. Снова осторожно перемешать содержимое и написать дату разведения на этикетке емкости. Перед применением поставить бутыль на 90 минут непосредственно в реагентный отсек анализатора или в холодильник и дать постоять.
Калибраторы: Готовы к использованию. Перемешать содержимое, осторожно переворачивая емкости, следя за тем, чтобы не было пенообразования.
ПРИМЕЧАНИЕ 1: Входящие в этот набор компоненты предназначены только для использования в комплекте. Нельзя смешивать компоненты из разных наборов.
ПРИМЕЧАНИЕ 2: Избегайте перекрёстного загрязнения реагентов, следя за тем, чтобы крышки от емкостей соответствовали нужным емкостям. Рабочий раствор R2 (донор фермента) должен быть желто-оранжевого цвета. Красный или пурпурно-красный цвет раствора говорит о загрязнении реагента, и в таком случае его следует вылить.
ПРИМЕЧАНИЕ 3: Перед проведением теста температура рабочих растворов R1 и R2 должна быть равна температуре реагентного отсека анализатора.
ПРИМЕЧАНИЕ 4: Для обеспечения стабильности разведенного раствора АФ необходимо беречь его от длительного воздействия яркого света.
Хранить реагенты при температуре 2-8°C. НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ. Стабильность невскрытых емкостей с компонентами: срок годности указан на этикетке на коробке или на емкости.
Раствор R1: 60 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.
Раствор R2: 60 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.
Калибраторы: до истечения срока годности при температуре 2-8°С.
Сбор и обработка образцов
При анализе можно использовать образцы сыворотки или плазмы (K гепарин, Na гепарин, Li гепарин или ЭДТА). Для обеспечения сохранности образца со времени сбора до момента анализа необходимо избегать пенообразования у образцов, а также повторного замораживания и оттаивания. Образцы, содержащие твёрдые частицы, следует центрифугировать. Образцы должны храниться закрытыми при температуре 2-8°С, и анализ следует провести в течение 1 недели после сбора. Если невозможно провести анализ в течение 1 недели или если образец необходимо транспортировать, то образцы должны храниться закрытыми и в замороженном состоянии. При температуре -20°С образцы могут храниться в течение 3 месяцев. Со всеми образцами пациентов следует обращаться так, как если бы они были потенциально заразными.
Процедура анализа
Для выполнения этого анализа можно использовать анализаторы, которые позволяют поддерживать постоянную температуру, дозирование образцов пипеткой, смешивание реагентов, измерение скорости ферментативной реакции и точное определение времени реакции. Инструкции по применению с конкретными параметрами приборов можно получить в компании Microgenics.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализатор не читает штрих-код, числовую последовательность на этикетке со штрих-кодом можно ввести вручную с помощью клавиатуры.
Контроль качества и калибровка3
Рекомендуется проводить двухточечную калибровку
• в качестве контрольной калибровки каждые 24 часа
• после смены емкости с реагентом
• после смены партии реагентов
• согласно требованиям процедур контроля качества
Рекомендации по хорошей лабораторной практике предполагают проведение контроля качества не менее чем на двух уровнях (низкая и высокая точка) каждый день, когда анализируются образцы пациентов, и каждый раз при проведении калибровки. Отслеживайте контрольные значения на предмет каких-либо тенденций или сдвигов. В случае обнаружения каких-либо тенденций или сдвигов, или если результаты контроля не отвечают указанному диапазону, необходимо проверить все рабочие параметры. Обратитесь в Службу технической поддержки компании Microgenics за дополнительной помощью.
Ограничения
- Образцы от пациентов, применяющих препарат Uzara® для лечения диареи, могут показать ошибочно высокие концентрации дигитоксина.
- Число пациентов, у которых имеются антитела к b-галактозидазе E. coli, чрезвычайно мало. Однако некоторые образцы, содержащие такие антитела, могут показать ошибочно высокие концентрации дигитоксина, не соответствующие клиническому профилю пациента.
Результаты и ожидаемые значения
Тест Дигитоксин CEDIA предназначен для количественного анализа образцов пациентов от 3 нг/мл до 50 нг/мл. Если образец показывает результат менее 3 нг/мл, то в отчете следует указать < 3 нг/мл. Если образец показывает результат свыше 50 нг/мл, в отчете можно либо указать > 50 нг/мл, либо разбавить образец пациента в соотношении один к одному образцом, не содержащим дигитоксина, и провести повторный анализ. Численный результат повторного анализа вычисляется следующим образом:
Фактическое значение = 2 х значение разведенного образца
Для пересчета нг/мл в нмоль/л использовать следующий коэффициент пересчёта:
нг/мл х 1.3 = нмоль/л
нмоль/л х 0.77 = нг/мл
У многих пациентов терапевтический эффект не достигается, если концентрация дигитоксина ниже 25 - 30 нг/мл4. С другой стороны, уровни дигитоксина в сыворотке выше 30 нг/мл обычно считаются токсичными. Однако токсичность может также наблюдаться и при более низких уровнях5. Поэтому для диагностических целей при оценке результатов дигитоксина пациента следует всегда учитывать историю болезни, клинические исследования и другие факторы.
Типичные рабочие характеристики
Для анализатора Hitachi6 были получены следующие типичные рабочие характеристики. Результаты, полученные в отдельных лабораториях, могут отличаться от приведенных здесь.
Воспроизводимость
Воспроизводимость определялась с использованием стандартов во внутреннем протоколе:
|
|
В пределах прогона (n=20) |
Между разными днями (n=17) |
||||
|
Образец |
Среднее значение, нг/мл |
Данные выборки, нг/мл |
Коэффициент вариации, % |
Среднее значение, нг/мл |
Данные выборки, нг/мл |
Коэффициент вариации, % |
|
Контроль 1 |
10,07 |
0,70 |
6,95 |
9,48 |
1,12 |
11,81 |
|
Контроль 2 |
16,66 |
0,66 |
3,96 |
18,21 |
1,60 |
8,79 |
|
Контроль 3 |
44,02 |
0,85 |
1,93 |
45,46 |
1,39 |
3,06 |
Сравнение методов
Сравнение результатов, полученных с помощью теста Дигитоксин CEDIA (y), с результатами доступного на рынке флуоресцентного поляризационного иммуноанализа (x), дало следующую корреляцию (нг/мл):
|
Линейная регрессия |
Регрессия Пассинга/Баблока |
|
|
|
Число образцов: 134
Концентрации образцов находились в диапазоне от 3.1 до 49.0 нг/мл.
Линейность
Образец с высоким содержанием был разбавлен калибратором низкого диапазона CEDIA. Затем был определен процент выхода путем деления значения, полученного в результате теста, на ожидаемое значение.
|
% образца с высоким содержанием |
Ожидаемое значение (нг/мл) |
Значение, полученное в результате теста (нг/мл) |
% выхода |
|
100 75 50 25 |
--- 26,12 17,42 8,71 |
34,83 26,93 18,30 9,35 |
100,00 103,10 105,10 107,30 |
Выход
Дигитоксин был добавлен к образцу низкого диапазона от пациента. Затем был определен процент выхода путем деления значения, полученного в результате теста, на ожидаемое значение.
|
Количество добавленного дигитоксина (нг/мл) |
Ожидаемое значение (нг/мл) |
Значение, полученное в результате теста (нг/мл) |
% выхода |
|
0 9,57 19,14 28,70 |
--- 18,60 28,17 37,73 |
9,03 19,25 28,39 38,68 |
--- 103,50 100,80 103,00 |
Специфичность
Были протестированы следующие соединения на перекрестную реактивность.
|
Соединение |
% перекрестной реактивности |
|
Десланозид Дигитоксигенин Дигитоксигенин-бисдигитоксизид Дигитоксигенин-монодигитоксизид Дигоксигенин Дигоксин Дигидродиогоксин Фуросемид Гитален Уабаин Преднизолон Преднизон Прогестерон Хинидин (свободное основание) Хинидин (HCl) Спиронолактон Тестостерон Теофиллин |
3,8 217,4 138,9 177,3 3,9 5,3 <0,1 <0,1 34,7 1,9 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 <0,1 |
Не выявлено перекрёстного взаимодействия теста Дигитоксин CEDIA со следующими веществами:
|
Вещество |
Концентрация |
|
Билирубин Гемоглобин Триглицерид |
≤60мг/дл ≤1000мг/дл ≤2000мг/дл |
Чувствительность
Минимальная концентрация, определяемая с помощью теста Дигитоксин CEDIA: 3 нг/мл.