Тест Гентамицин II CEDIA®

Тест Гентамицин II CEDIA^®

Для диагностики in vitro

 

Кат. № 100016 (Комплекты 13 х 11 мл)

 Назначение

Тест Гентамицин II CEDIA^® – это набор реагентов для диагностики in vitro, предназначенный для количественного определения содержания гентамицина в сыворотке или в плазме человека.

 Резюме и разъяснение теста

Гентамицин – это аминогликозидный антибиотик, используемый для лечения инфекций, вызванных E. coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Serratia, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis и другими микроорганизмами. Токсическое действие гентамицина вызвано его ингибированием синтеза рибосомного белка^1,2. Гентамицин очень слабо поддается метаболизму (если вообще поддается), и поэтому выводится из организма клубочковой фильтрацией как исходное лекарственное вещество.

Терапевтический диапазон следует измерять как при пиковой, так и при минимальной концентрации. Пиковые концентрации гентамицина в сыворотке или в плазме предлагаются для того, чтобы обеспечить адекватную противомикробную активность. Минимальные концентрации гентамицина обычно гарантируют, что выведение препарата происходит адекватно, и его концентрация превышает минимальную ингибирующую концентрацию. Концентрация гентамицина в сыворотке или в плазме зависит от способа введения, объема внеклеточной жидкости, длительности лечения и физиологических изменений в ходе болезни и лечения. Поэтому мониторинг уровней пиковой и минимальной концентрации гентамицина в сыворотке или в плазме имеет важное значение для предотвращения серьезных осложнений и для соответствующей корректировки дозировки препарата^4,5.

В тесте Гентамицин II CEDIA применена технология рекомбинатной ДНК (патент США №4708929) для получения уникальной системы гомогенного иммуноферментного анализа⁶.

В основе теста лежит бактериальный фермент b-галактозидаза, который с помощью генной инженерии был разделен на два неактивных фрагмента: акцептор фермента (АФ) и донор фермента (ДФ). Эти фрагменты спонтанно связываются вновь, образуя действующий фермент, который в формате теста расщепляет субстрат, что приводит к изменению цвета, которое можно измерить методом спектрофотометрии.

В ходе теста, анализируемое вещество в образце конкурирует за место связывания антитела с анализируемым веществом, сопряженным с одним неактивным фрагментом b-галактозидазы. Если в образце присутствует анализируемое вещество, оно связывается с антителами, при этом неактивные фрагменты фермента свободно объединяются, образуя активный фермент. Если в образце отсутствует анализируемое вещество, антитело связывается с анализируемым веществом, сопряженным с неактивным фрагментом, подавляя повторное соединение неактивных фрагментов b-галактозидазы, при этом не происходит образования активного фермента. Количество образованного активного фермента и вызванное этим изменение коэффициента поглощения прямо пропорциональны содержанию препарата в образце⁸.

Реагенты

1 Буферный растворитель АФ: Содержит 3-(N-морфолино) пропан-сульфоновую кислоту, буферные соли, ПАВ и консервант (13 мл).

1а Реагент АФ: Содержит акцептор фермента (0.14 г/л); моноклональное антитело к гентамицину (9.3 мг/л), буферные соли, стабилизатор и консервант.

2 Буферный растворитель ДФ: Содержит 3-(N-морфолино) пропан-сульфоновую кислоту, буферные соли, ПАВ и консервант (11 мл).

2а Реагент ДФ: Содержит донор фермента, сопряженный с гентамицином (38 мкг/л); хлорфенол красный-b-D-галактопиранозид, (2.36 г/л); козьи антитела к мышиным, буферные соли, стабилизатор и консервант.

Требуемые дополнительные материалы, не входящие в комплект поставки (продаются отдельно):

Мульти-калибраторы CEDIA Antibiotic TDM Multi-Cal, Кат. № 100017

Имеющиеся в продаже контрольные материалы. Обратитесь в Службу технической поддержки компании Microgenics, чтобы получить рекомендации относительно подходящих контрольных материалов.

 

Меры предосторожности и предупреждения

Реагенты содержат азид натрия. Избегать попадания реагентов на кожу и слизистые оболочки. Промыть пораженные участки большим количеством воды. В случае попадания в глаза или при проглатывании немедленно обратиться к врачу. Азид натрия может вступать в реакцию со свинцовыми или медными водопроводными трубами, образуя взрывоопасные азиды металлов. При утилизации таких реагентов всегда смывать их большим количеством воды во избежание отложений азидов. Подверженные воздействию металлические поверхности очистить 10%  гидроксидом натрия.

 

Приготовление и хранение реагентов

Ниже приведена процедура приготовления растворов для анализаторов фирмы Hitachi. Для всех других анализаторов смотрите инструкции по применению конкретного анализатора.

Вынимать комплект из холодильника следует непосредственно перед приготовлением растворов.

Приготовление растворов производите в следующем порядке, чтобы максимально уменьшить вероятность возможного загрязнения.

 

Раствор донора фермента R2: Соединить емкость 2а (реагент ДФ) с емкостью 2 (буферный растворитель ДФ) с помощью одного из прилагаемых переходников. Смешать содержимое, осторожно переворачивая емкости так, чтобы весь лиофилизированный материал из емкости 2а оказался в емкости 2, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить от емкости 2 и выбросить емкость 2а с переходником. Закрыть емкость 2 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при температуре 15-25°С. Снова перемешать содержимое и написать дату разведения на этикетке емкости. Перед применением поставить бутыль на 30 минут непосредственно в реагентный отсек анализатора или в холодильник и дать постоять.

 

Раствор акцептора фермента R1: Соединить емкость 1а (реагент АФ) с емкостью 1 (буферный растворитель АФ) с помощью одного из прилагаемых переходников. Смешать содержимое, осторожно переворачивая емкости так, чтобы весь лиофилизированный материал из бутыли 1а оказался в бутыли 1, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить от емкости 1 и выбросить емкость 1а с переходником. Закрыть наполненную емкость 1 крышкой и оставить примерно на 5 минут при температуре 15-25°С. Снова перемешать содержимое и написать дату разведения на этикетке емкости. Перед применением поставить бутыль на 30  минут непосредственно в реагентный отсек анализатора или в холодильник и дать постоять.

ПРИМЕЧАНИЕ 1: Входящие в этот набор компоненты предназначены только для использования в комплекте. Нельзя смешивать компоненты из разных наборов.

ПРИМЕЧАНИЕ 2: Избегайте перекрёстного загрязнения реагентов, следя за тем, чтобы крышки от емкостей соответствовали нужным емкостям. Рабочий раствор R2 (донор фермента) должен быть желто-оранжевого цвета. Красный или пурпурно-красный цвет раствора говорит о загрязнении реагента, и в таком случае его следует вылить.

ПРИМЕЧАНИЕ 3: Перед проведением теста температура рабочих растворов R1 и R2 должна быть равна температуре реагентного отсека анализатора. См. дополнительно инструкции по применению конкретного анализатора.

ПРИМЕЧАНИЕ 4: Для обеспечения стабильности разведенного раствора АФ необходимо беречь его от длительного воздействия яркого света.

Хранить реагенты при температуре 2-8°C.  НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ. Стабильность невскрытых емкостей с компонентами: срок годности указан на этикетке на коробке или на емкости.

Раствор R1: 30 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.

Раствор R2: 30 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.

 

Сбор и обработка образцов

При анализе можно использовать образцы сыворотки или плазмы (Na гепарин или Li гепарин;  Na ЭДТА). Для  обеспечения сохранности образца со времени сбора до момента анализа необходимо избегать пенообразования у образцов, а также повторного замораживания и оттаивания. Образцы, содержащие твёрдые частицы, следует центрифугировать. Образцы должны храниться закрытыми при температуре 2-8°С, и анализ следует провести в течение 1 недели после сбора. Если невозможно провести анализ в течение 1 недели или если образец необходимо транспортировать, то образцы должны храниться закрытыми и в замороженном состоянии. При температуре -20°С образцы могут храниться в течение 4 недель. Со всеми образцами пациентов следует обращаться так, как если бы они были потенциально заразными.

 

Процедура анализа

Для выполнения этого анализа можно использовать анализаторы, которые позволяют поддерживать постоянную температуру, дозирование образцов пипеткой, смешивание реагентов, измерение скорости ферментативной реакции и точное определение времени реакции. Инструкции по применению с конкретными параметрами приборов можно получить в компании Microgenics.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализатор не читает штрих-код, числовую последовательность на этикетке со штрих-кодом можно ввести вручную с помощью клавиатуры.

Параметры настройки любых других анализаторов приведены в соответствующих инструкциях по применению приборов.

 

Контроль качества и калибровка⁷

 Рекомендуется проводить двухточечную калибровку

• после смены емкости с реагентом

• после смены партии реагентов

• согласно требованиям процедур контроля качества

 

Рекомендации по хорошей лабораторной практике предполагают проведение контроля качества не менее чем на двух уровнях (низкая и высокая точка) каждый день, когда анализируются образцы пациентов, и каждый раз при проведении калибровки. Отслеживайте контрольные значения на предмет каких-либо тенденций или сдвигов. В случае обнаружения каких-либо тенденций или сдвигов, или если результаты контроля не отвечают указанному диапазону, необходимо проверить все рабочие параметры. Свяжитесь со Службой технической поддержки компании Microgenics для получения дополнительной помощи.

 

Результаты и ожидаемые значения

 Тест Гентамицин II CEDIA предназначен для количественного анализа образцов пациентов от 0.24 мкг/мл до значения калибратора высокого диапазона Antibiotic TDM High Calibrator (12 мкг/мл). Если образец показывает результат менее 0.24 мкг/мл, то в отчете следует указать < 0.24 мкг/мл. Если образец показывает результат свыше 12 мкг/мл, в отчете можно либо указать > 12 мкг/мл, либо разбавить образец пациента в соотношении один к одному образцом калибратора низкого диапазона Antibiotic TDM Low Calibrator и провести повторный анализ. Численный результат повторного анализа вычисляется следующим образом:

Фактическое значение = (2 х значение разведенного образца) – концентрация калибратора низкого диапазона Antibiotic TDM Low Calibrator

Для пересчета мкг/мл в мкмоль/л использовать следующий коэффициент пересчёта:

мкг/мл х 2.09 = мкмоль/л

мкмоль/л х 0.49 = мкг/мл

Терапевтический эффект и токсичность тесно связаны с концентрацией препарата в сыворотке. Для взрослых, как правило, максимальный терапевтический эффект достигается при концентрации гентамицина от 5 до 8 мкг/мл. Минимальные концентрации в диапазоне 1-2 мкг/мл обычно гарантируют адекватное выведение препарата^1,5. Другие исследователи^2-4,8,9 приводят различные данные о терапевтическом диапазоне гентамицина.

 

Ограничения

 Число пациентов, у которых имеются антитела к b-галактозидазе E. coli, чрезвычайно мало. Однако некоторые образцы, содержащие такие антитела, могут показать ошибочно высокие результаты, не соответствующие клиническому профилю пациента.

1. Сизомицин демонстрирует существенное перекрестное влияние (> 50%) на тест Гентамицин II CEDIA.
2. Как и в любом тесте, использующем антитела мыши, существует вероятность влияния противомышиных антител человека (HAMA) в образце, что может привести к ошибочно завышенным результатам.

 Конкретные рабочие характеристики

Ниже показаны типичные данные¹⁰, полученные на анализаторе Hitachi 704. Результаты, получаемые в вашей лаборатории, могут от них отличаться.

 Воспроизводимость

Измерение воспроизводимости выполнялось на контрольной сыворотке и на смешанной сыворотке человека, на анализаторе Hitachi, с использованием модифицированных руководящих указаний NCCLS по проведению повторяющихся испытаний. Были получены следующие результаты:

	Воспроизводимость в пределах прогона			Общая воспроизводимость
n x (мкг/мл) SD (мкг/мл) CV%	120 1,7 0,09 5,3	120 6,9 0,22 3,2	120 9,6 0,19 2,0	120 1,7 0,11 6,2	120 6,9 0,28 4,1	120 9,6 0,28 3,0

 

Сравнение методов

Сравнение результатов, полученных в тесте Гентамицин II CEDIA (y), с результатами доступного на рынке флуоресцентного поляризационного иммуноанализа (x), дало следующую корреляцию (мкг/мл):

Регрессия   Деминга	Линейная   регрессия

Число образцов: 97

Концентрации образцов находились в диапазоне от 0.32 до 10.6 мкг/мл.

 Линейность

Образец с высоким содержанием препарата был разбавлен калибратором низкого диапазона Antibiotic TDM Low Calibrator. Затем был определен процент выхода путем деления значения, полученного в результате теста, на ожидаемое значение.

% образца с высоким содержанием	Ожидаемое значение (мкг/мл)	Значение, полученное в результате теста (мкг/мл)	% выхода
100 80 60 40 20	--- 5,3 4,0 2,6 1,3	6,6 5,2 3,9 2,5 1,2	--- 98 98 96 92

 Выход

Гентамицин в виде образца пациента с высоким содержанием препарата (обогащенного) был добавлен к образцу пациента с низким содержанием препарата. Затем был определен процент выхода путем деления значения, полученного в результате теста, на ожидаемое значение.

% образца с высоким содержанием	Ожидаемое значение (мкг/мл)	Значение, полученное в результате теста (мкг/мл)	% выхода
100 80 60 40 20 0	--- 5,6 4,6 3,6 2,7 ---	6,6 5,6 4,6 3,5 2,7 1,7	--- 100 100 97 100 ---

 

Специфичность

Тест Гентамицин II CEDIA является очень специфичным и имеет клинически несущественную перекрестную реактивность с веществами сходной структуры или с препаратами, принимаемыми совместно. Ниже приведена перекрестная реактивность для каждого соединения.

 

Не выявлено перекрёстного взаимодействия теста Гентамицин II CEDIA со следующими веществами: 

Вещество	Концентрация	Вещество	Концентрация
Билирубин Гемоглобин Иммуноглобулин   A Иммуноглобулин   G	≤ 60   мг/дл ≤   1,0 г/дл ≤   2,7 г/дл ≤   5,1 г/дл	Иммуноглобулин   M Ревматоидный   фактор Общий   белок Триглицерид	≤   2,6 г/дл ≤   1270 МЕ/мл ≤   12,0 г/дл ≤   1,0 г/дл

 Чувствительность

Минимальная концентрация, определяемая с помощью теста Гентамицин II CEDIA: 0.24 мкг/мл.