Тест Фенобарбитал II CEDIA®
Тест Фенобарбитал II CEDIA®
Для диагностики in vitro
Кат. № 100003 (комплект 17 мл)
Назначение
Тест Фенобарбитал II CEDIA® – это набор реагентов для диагностики in vitro, предназначенный для количественного определения содержания фенобарбитала в сыворотке и в плазме человека.
Резюме и разъяснение теста
Фенобарбитал широко используется для лечения эпилепсии, особенно для прекращения фокальных моторных, сенсорных или больших эпилептических припадков1,2. Пероральные дозы фенобарбитала от 2 до 3 мг/кг всасываются почти полностью, причем пиковые уровни достигаются через интервал от 12 до 18 ч3. Примерно 40-50% фенобарбитала в системе кровообращения связывается с белками плазмы, при сравнительно низких константах ассоциации4. Основной метаболический путь фенобарбитала – это гидроксилирование фенильного кольца с образованием p-гидроксифенобарбитала, агента, не имеющего снотворного действия, который затем выводится с мочой, в равных количествах в свободной форме и в форме, сопряженной с глюкуроновой кислотой4. Концентрация фенобарбитала от 15 до 40 мкг/мл в сыворотке обычно считается оптимальным терапевтическим диапазоном для максимально эффективного предотвращения припадков5.
Необходимость мониторинга концентрации фенобарбитала вызвана узким терапевтическим диапазоном и широкой изменчивостью индивидуальных скоростей поглощения, метаболизма и выведения препарата7. Токсичность при терапии фенобарбиталом может проявляться в виде седативного эффекта, нистагма, атаксии, парадоксального возбуждения, дискразии крови (включая дефекты свертывания у новорожденных детей, матери которых принимали препарат во время беременности), неспецифических изменений печени, сыпи (включая тяжелые шелушащиеся формы), остеомаляции, плечевого синдрома и комы3,8,9,10,11. В сочетании с другой клинической информацией, мониторинг уровня фенобарбитала в сыворотке или в плазме может дать врачу необходимый инструмент для корректировки индивидуальной дозировки, достижения оптимального терапевтического эффекта и избегания как концентрации препарата, не дающей терапевтического эффекта, так и вредной токсичной концентрации.
В тесте Фенобарбитал II CEDIA применена технология рекомбинатной ДНК (патент США №4708929) для получения уникальной системы гомогенного иммуноферментного анализа12.
В основе теста лежит бактериальный фермент b-галактозидаза, который с помощью генной инженерии был разделен на два неактивных фрагмента. Эти фрагменты спонтанно связываются вновь, образуя действующий фермент, который в формате теста расщепляет субстрат, что приводит к изменению цвета, которое можно измерить методом спектрофотометрии.
В тесте используется формат вытеснения, чтобы повысить чувствительность и воспроизводимость за счет снижения фонового шума и соответствующего увеличения отношения сигнал – шум. В ходе теста, фенобарбитал в образце частично замещает антитела сопряженного комплекса ДФ-фенобарбитал (ДФ - донор фермента). Затем добавляется реагент АФ (акцептор фермента), и реагенты выдерживаются, чтобы обеспечить комплементацию со свободным сопряженным комплексом ДФ-фенобарбитал.
Количество образованного активного фермента и вызванное этим изменение коэффициента поглощения прямо пропорциональны содержанию анализируемого вещества в образце12.
Реагенты
1 Буферный растворитель ДФ: Содержит MOPS (3-[N-морфолино]-пропан-сульфоновую кислоту), буферные соли и консервант.
1а Реагент ДФ: Содержит донор фермента, сопряженный с фенобарбиталом (38 мкг/л); моноклональные антитела мыши к фенобарбиталу (16.1 мг/л), хлорфенол красный-b-галактопиранозид (1.64 г/л) буферные соли и консервант.
2 Буферный растворитель АФ: Содержит MOPS (буфер в виде 3-[N-морфолино]-пропан-сульфоновой кислоты), буферные соли, антитела козы к антителам мыши (0.945 г), стабилизаторы и консервант.
2а Реагент АФ: Содержит акцептор фермента (0.171 г/л), разделительное средство, буферные соли и консервант.
Требуемые дополнительные материалы, не входящие в комплект поставки (продаются отдельно):
Мульти-калибраторы CEDIA Core TDM Multi-Cal, Кат. № 100007
Имеющиеся в продаже контрольные материалы - Обратитесь в Службу технической поддержки компании Microgenics, чтобы получить рекомендации относительно подходящих контрольных материалов.
Меры предосторожности и предупреждения
- Использовать только для диагностических целей in vitro.
- Реагенты содержат азид натрия с концентрацией ниже 1%. Избегать попадания реагентов на кожу и слизистые оболочки. Промыть пораженные участки большим количеством воды. В случае попадания в глаза или при проглатывании немедленно обратиться к врачу. Азид натрия может вступать в реакцию со свинцовыми или медными водопроводными трубами, образуя взрывоопасные азиды металлов. При утилизации таких реагентов всегда смывать их большим количеством воды во избежание отложений азидов. Подверженные воздействию металлические поверхности очистить 10% гидроксидом натрия.
Приготовление и хранение реагентов
Ознакомьтесь с инструкцией по применению и проверьте, нет ли в ней исключений из инструкции, приведенных ниже. Вынимать комплект из холодильника (2-8°С) следует непосредственно перед приготовлением растворов.
Приготовление растворов производите в следующем порядке, чтобы максимально уменьшить вероятность возможного загрязнения:
Раствор донора фермента R1: Соединить емкость 1а (реагент ДФ) с емкостью 1 (буферный растворитель ДФ) с помощью одного из прилагаемых переходников. Смешать содержимое, осторожно переворачивая емкости так, чтобы весь лиофилизированный материал из емкости 1а оказался в емкости 1, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить от емкости 1 и выбросить емкость 1а с переходником. Закрыть емкость 1 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при температуре 15-25°С. Снова перемешать содержимое и написать дату разведения на этикетке емкости.
Раствор акцептора фермента R2: Соединить емкость 2а (реагент АФ) с емкостью 2 (буферный растворитель АФ) с помощью одного из прилагаемых переходников. Смешать содержимое, осторожно переворачивая емкости так, чтобы весь лиофилизированный материал из бутыли 2а оказался в бутыли 2, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить от емкости 2 и выбросить емкость 2а с переходником. Закрыть наполненную емкость 2 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при температуре 15-25°С. Снова перемешать содержимое и написать дату разведения на этикетке емкости.
ПРИМЕЧАНИЕ 1: Входящие в этот набор компоненты предназначены только для использования в комплекте. Нельзя смешивать компоненты из разных наборов.
ПРИМЕЧАНИЕ 2: Избегайте перекрёстного загрязнения реагентов, следя за тем, чтобы крышки от емкостей соответствовали нужным емкостям. Рабочий раствор R1 должен быть желто-оранжевого цвета. Красный или пурпурно-красный цвет раствора говорит о загрязнении реагента, и в таком случае его следует вылить.
ПРИМЕЧАНИЕ 3: Перед проведением теста температура рабочих растворов R1 и R2 должна быть равна температуре реагентного отсека анализатора. См. дополнительную информацию в инструкции по применению анализатора.
ПРИМЕЧАНИЕ 4: Для обеспечения стабильности разведенного раствора АФ необходимо беречь его от длительного воздействия яркого света.
Хранить реагенты при температуре 2-8°C. НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ. Стабильность невскрытых емкостей с компонентами: срок годности указан на этикетке на коробке или на емкости.
Раствор R1: 60 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.
Раствор R2: 60 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.
Сбор и обработка образцов
При анализе Фенобарбитал II CEDIA можно использовать образцы сыворотки или плазмы (Na гепарин или Li гепарин; Na ЭДТА). Для обеспечения сохранности образца сыворотки или плазмы со времени сбора до момента анализа необходимо избегать пенообразования у образцов, а также повторного замораживания и оттаивания. Образцы, содержащие твёрдые частицы, следует центрифугировать. Образцы должны храниться закрытыми при температуре 2-8°С, и анализ следует провести в течение 24 часов после сбора. Если невозможно провести анализ в течение 24 часов или если образец необходимо транспортировать, то образцы должны храниться закрытыми и в замороженном состоянии. При температуре -20°С образцы могут храниться в течение 2 недель.
Если образцы хранятся в пробирке с разделительным гелем долгое время (> 2 ч), то концентрация некоторых препаратов снижается13.
Процедура анализа
Для выполнения этого анализа можно использовать анализаторы, которые позволяют поддерживать постоянную температуру, дозирование образцов пипеткой, смешивание реагентов, измерение скорости ферментативной реакции и точное определение времени реакции. В этом анализе используется двухточечная калибровка. В случае применения анализаторов Hitachi, следует использовать калибратор низкого уровня CEDIA Core TDM Multi-Cal Low Calibrator в качестве S1 и калибратор высокого уровня CEDIA Core TDM Multi-Cal High Calibrator в качестве S2. Точные параметры настройки конкретного анализатора приведены в соответствующих инструкциях по применению приборов, которые можно получить в Отделе технической поддержки компании Microgenics.
Анализатор Hitachi 911: Если анализатор не читает штрих-код, числовую последовательность на этикетке со штрих-кодом можно ввести вручную с помощью клавиатуры.
Контроль качества и калибровка
Рекомендации по хорошей лабораторной практике предполагают проведение контроля качества не менее чем на двух уровнях (низкая и высокая точка) каждый день, когда анализируются образцы пациентов, и каждый раз при проведении калибровки. Отслеживайте контрольные значения на предмет каких-либо тенденций или сдвигов. В случае обнаружения каких-либо тенденций или сдвигов, или если результаты контроля не отвечают указанному диапазону, необходимо проверить все рабочие параметры. Свяжитесь со Службой технической поддержки компании Microgenics для получения дополнительной помощи и рекомендаций относительно подходящего контрольного материала. ПРИМЕЧАНИЕ: При смене партии реагентов следует определить заново контрольные показатели и диапазоны.
Частота калибровки - Рекомендуется проводить двухточечную калибровку:
• после смены емкости с реагентом
• после смены партии реагентов
• согласно требованиям процедур контроля качества
Результаты и ожидаемые значения
Для большинства пациентов терапевтический эффект достигается при концентрации фенобарбитала в диапазоне 15-40 мкг/мл (65-172 мкмоль/л)5. Некоторым пациентам для эффективного прекращения припадка может потребоваться концентрация фенобарбитала, выходящая за этот диапазон. Поэтому терапевтический диапазон приводится только в качестве справочной информации, и индивидуальные результаты пациента должны интерпретироваться в сочетании с другими клиническими симптомами и индивидуальной клинической историей.
Тест Фенобарбитал II CEDIA предназначен для количественного анализа образцов пациентов с концентрацией от 1.2 мкг/мл до 80 мкг/мл (калибратор высокого уровня CEDIA Core TDM Multi-Cal High Calibrator). Если образец показывает результат за пределами диапазона, в отчете можно указать > 80 мкг/мл или < 1.2 мкг/мл (предел чувствительности теста).
Если образец показывает результат свыше 80 мкг/мл, можно также разбавить образец пациента в соотношении один к одному образцом калибратора низкого диапазона и провести повторный анализ. Численный результат повторного анализа вычисляется следующим образом:
Фактическое значение = (2 х значение разведенного образца) – концентрация калибратора низкого диапазона
Для пересчета нг/мл в нмоль/л использовать следующий коэффициент пересчёта:
мкг/мл х 4.31 = мкмоль/л
мкмоль/л х 0.232 = мкг/мл
Ограничения
- Работоспособность теста Фенобарбитал II CEDIA не проверялась с другими жидкостями в организме, кроме сыворотки и плазмы (Na гепарин или Li гепарин; Na ЭДТА).
- Число пациентов, у которых имеются антитела к b-галактозидазе E. coli, чрезвычайно мало. Однако некоторые образцы, содержащие такие антитела, могут показать ошибочно высокие результаты, не соответствующие клиническому профилю пациента. В таком случае обратитесь за помощью в Службу технической поддержки компании Microgenics.
- Этот тест был опробован на анализаторах, использующих встроенную станцию промывки кювет. Если ваш анализатор не оснащен встроенной станцией промывки кювет, обратитесь к вашему местному представителю компании Microgenics за альтернативной процедурой.
Конкретные рабочие характеристики
Ниже показаны типичные данные13, полученные на анализаторе Hitachi 911. Результаты, получаемые в вашей лаборатории, могут от них отличаться.
Воспроизводимость
Измерение воспроизводимости выполнялось анализатором Hitachi 911 на упакованных реагентах, смешанной сыворотке человека и контрольной сыворотке, с использованием руководящих указаний NCCLS по проведению модифицированных повторяющихся испытаний. Были получены следующие результаты (в мкг/мл):
|
Воспроизводимость в пределах прогона |
Общая воспроизводимость |
||||
N x (мкг/мл) SD (мкг/мл) CV% |
120 9.4 0.2 2.1 |
120 25.9 0.5 1.9 |
120 9.4 0.5 5.3 |
120 25.9 1.0 3.8 |
120 25.9 1.0 3.8 |
120 52.7 1.9 3.6 |
Сравнение методов
Сравнение результатов, полученных при тесте Фенобарбитал II CEDIA (y), с результатами доступного на рынке флуоресцентного поляризационного иммуноанализа (x), дало следующую корреляцию (мкг/мл):
Регрессия Деминга |
Линейная регрессия |
|
|
Число образцов: 126
Концентрации образцов находились в диапазоне от 1.7 до 73.3 мкг/мл.
Линейность
Для оценки линейности теста образец высокого диапазона был разбавлен калибратором низкого диапазона Core TDM Multi-Cal Low Calibrator. Затем был определен процент выхода путем деления значения, полученного в результате теста, на ожидаемое значение.
% образца с высоким содержанием |
Ожидаемое значение (мкг/мл) |
Значение, полученное в результате теста (мкг/мл) |
% выхода |
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 |
--- 78.4 69.8 61.1 52.5 43.8 35.2 26.5 17.8 9.2 --- |
84.6 75.6 66.0 60.4 52.9 44.6 34.7 26.6 14.7 9.1 0.6 |
--- 96.4 94.6 98.8 101.9 101.9 98.8 100.4 99.1 99.1 --- |
Выход
Для оценки выхода теста, фенобарбитал был добавлен к образцу низкого диапазона и был разбавлен разными объемами образца, в котором отсутствовало анализируемое вещество. Затем был определен процент выхода путем деления значения, полученного в результате теста, на ожидаемое значение.
% образца с высоким содержанием |
Ожидаемое значение (мкг/мл) |
Значение, полученное в результате теста (мкг/мл) |
% выхода |
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 |
--- 83.0 73.8 64.5 55.3 46.0 36.8 27.6 18.3 9.1 --- |
85.4 78.1 71.6 63.5 55.8 46.7 37.0 27.7 17.9 8.9 0.1 |
--- 94.0 97.1 98.6 100.8 101.4 100.6 100.6 97.7 98.5 --- |
Специфичность
На перекрестную реактивность с тестом Фенобарбитал II CEDIA были протестированы следующие соединения:
Не выявлено перекрёстного взаимодействия теста Фенобарбитал II CEDIA со следующими веществами:
Вещество |
Концентрация |
Вещество |
Концентрация |
Билирубин Гемоглобин Ревматоидный фактор |
≤ 66 мг/дл ≤ 1000 мг/дл ≤ 180 МЕ/мл |
Общий белок Триглицериды
|
≤ 13 г/дл ≤ 1000 мг/дл |
Амобарбитал (>20%) и мефобарбитал (>100%) демонстрируют значительное перекрёстное взаимодействие с тестом Фенобарбитал II CEDIA.
Чувствительность
Минимальная концентрация, определяемая с помощью теста Фенобарбитал II CEDIA: 1.2 мкг/мл (5.2 мкмоль/л). Это значение было определено путем расчета концентрации фенобарбитала, которая дала бы реакцию, равную двум стандартным отклонениям выше калибратора низкого диапазона Core TDM Multi-Cal Low Calibrator.