Тест Фенитоин II CEDIA®
Тест Фенитоин II CEDIA®
Для диагностики in vitro
Кат. № 100002 (комплект 17 мл)
Назначение
Тест Фенитоин II CEDIA® – это набор реагентов для диагностики in vitro, предназначенный для количественного определения содержания фенитоина в сыворотке и в плазме человека.
Резюме и разъяснение теста
Фенитоин (дифенин или дилантин - Dilantin®) – это широко используемое противосудорожное средство для лечения эпилепсии, особенно для прекращения больших эпилептических (моторных) припадков, кортикальных, фокальных припадков и височной эпилепсии1.
Концентрации фенитоина в сыворотке от 10 до 20 мкг/мл для взрослых2,3,4-7 и от 6 до 14 мкг/мл для детей2 считаются терапевтическим диапазоном для эффективного прекращения припадков7,8. Токсичность фенитоина часто зависит от дозы и влияет главным образом на центральную нервную систему. Необходимо проводить мониторинг концентрации фенитоина в сыворотке во время терапии, чтобы предоставить врачу показатель для корректировки дозы, достижения оптимального терапевтического эффекта и во избежание как концентрации препарата, не дающей терапевтического эффекта, так и вредной токсичной концентрации1,7.
В тесте Фенитоин II CEDIA применена технология рекомбинатной ДНК (патент США №4708929) для получения уникальной системы гомогенного иммуноферментного анализа8.
В основе теста лежит бактериальный фермент b-галактозидаза, который с помощью генной инженерии был разделен на два неактивных фрагмента. Эти фрагменты спонтанно связываются вновь, образуя действующий фермент, который в формате теста расщепляет субстрат, что приводит к изменению цвета, которое можно измерить методом спектрофотометрии.
В ходе теста, анализируемое вещество в образце конкурирует за место связывания антитела с анализируемым веществом, сопряженным с одним неактивным фрагментом b-галактозидазы. Если в образце присутствует анализируемое вещество, оно связывается с антителами, при этом неактивные фрагменты фермента свободно объединяются, образуя активный фермент. Если в образце отсутствует анализируемое вещество, антитело связывается с анализируемым веществом, сопряженным с неактивным фрагментом, подавляя повторное соединение неактивных фрагментов b-галактозидазы, при этом не происходит образования активного фермента. Количество образованного активного фермента и вызванное этим изменение коэффициента поглощения прямо пропорциональны содержанию препарата в образце.
Реагенты
1 Буферный растворитель АФ (акцептора фермента): Содержит MOPS (3-[N-морфолино]-пропан-сульфоновую кислоту), моноклональные антитела к фенитоину (35 мг/л), буферные соли, стабилизатор и консервант.
1а Реагент АФ: Содержит акцептор фермента (0.171 г/л), разделительное средство, детергент, буферные соли и консервант.
2 Буферный растворитель ДФ (донора фермента): Содержит MOPS (3-[N-морфолино]-пропан-сульфоновую кислоту), буферные соли и консервант.
2а Реагент ДФ: Содержит донор фермента, сопряженный с фенитоином (19 мкг/л), хлорфенол красный-b-D-галактопиранозид (1.64 г/л), буферные соли, стабилизатор и консервант.
Требуемые дополнительные материалы, не входящие в комплект поставки (продаются отдельно):
Мульти-калибраторы CEDIA Core TDM Multi-Cal (Кат. № 100007)
Имеющиеся в продаже контрольные материалы
Меры предосторожности и предупреждения
Реагенты содержат азид натрия. Избегать попадания реагентов на кожу и слизистые оболочки. Промыть пораженные участки большим количеством воды. В случае попадания в глаза или при проглатывании немедленно обратиться к врачу. Азид натрия может вступать в реакцию со свинцовыми или медными водопроводными трубами, образуя взрывоопасные азиды металлов. При утилизации таких реагентов всегда смывать их большим количеством воды во избежание отложений азидов. Подверженные воздействию металлические поверхности очистить 10% гидроксидом натрия.
Приготовление и хранение реагентов
Вынимать комплект из холодильника следует непосредственно перед приготовлением растворов.
Приготовление растворов производите в следующем порядке, чтобы максимально уменьшить вероятность возможного загрязнения:
Раствор донора фермента R2: Соединить емкость 2а (реагент ДФ) с емкостью 2 (буферный растворитель ДФ) с помощью одного из прилагаемых переходников. Смешать содержимое, осторожно переворачивая емкости так, чтобы весь лиофилизированный материал из емкости 2а оказался в емкости 2, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить от емкости 2 и выбросить емкость 2а с переходником. Закрыть емкость 2 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при комнатной температуре (15-25°С). Снова перемешать содержимое и написать дату разведения на этикетке емкости. Перед применением поставить бутыль на 30 минут непосредственно в реагентный отсек анализатора или в холодильник (2-8°С) и дать постоять.
Раствор акцептора фермента R1: Соединить емкость 1а (реагент АФ) с емкостью 1 (буферный растворитель АФ) с помощью одного из прилагаемых переходников. Смешать содержимое, осторожно переворачивая емкости так, чтобы весь лиофилизированный материал из бутыли 1а оказался в бутыли 1, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить от емкости 1 и выбросить емкость 1а с переходником. Закрыть наполненную емкость 1 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при температуре 15-25°С. Снова перемешать содержимое и написать дату разведения на этикетке емкости. Перед применением поставить бутыль на 30 минут непосредственно в реагентный отсек анализатора или в холодильник (2-8°С) и дать постоять.
ПРИМЕЧАНИЕ 1: Входящие в этот набор компоненты предназначены только для использования в комплекте. Нельзя смешивать компоненты из разных наборов.
ПРИМЕЧАНИЕ 2: Избегайте перекрёстного загрязнения реагентов, следя за тем, чтобы крышки от емкостей соответствовали нужным емкостям. Раствор R2 (донор фермента) должен быть желто-оранжевого цвета. Красный или пурпурно-красный цвет раствора говорит о загрязнении реагента, и в таком случае его следует вылить.
ПРИМЕЧАНИЕ 3: Перед проведением теста температура растворов R1 и R2 должна быть равна температуре реагентного отсека анализатора. См. дополнительную информацию в инструкции по применению анализатора.
ПРИМЕЧАНИЕ 4: Для обеспечения стабильности разведенного раствора АФ необходимо беречь его от длительного воздействия яркого света.
Хранить реагенты при температуре 2-8°C. НЕ ЗАМОРАЖИВАТЬ. Стабильность невскрытых емкостей с компонентами: срок годности указан на этикетке на коробке или на емкости.
Раствор R1: 60 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.
Раствор R2: 60 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.
Сбор и обработка образцов
При анализе Фенитоин II CEDIA можно использовать образцы сыворотки или плазмы (Na гепарин или Li гепарин; Na ЭДТА). Для обеспечения сохранности образца сыворотки или плазмы со времени сбора до момента анализа необходимо избегать пенообразования у образцов, а также повторного замораживания и оттаивания. Образцы, содержащие твёрдые частицы, следует центрифугировать. Образцы должны храниться закрытыми при температуре 2-8°С, анализ следует провести в течение 1 недели после получения образца. Если невозможно провести анализ в течение 1 недели или если образец необходимо транспортировать, то образцы должны храниться закрытыми и в замороженном состоянии. При температуре -20°С образцы могут храниться в течение 4 недель. Со всеми образцами пациентов следует обращаться так, как если бы они были потенциально заразными.
Процедура анализа
Для выполнения этого анализа можно использовать анализаторы, которые позволяют поддерживать постоянную температуру, дозирование образцов пипеткой, смешивание реагентов, измерение скорости ферментативной реакции и точное определение времени реакции. В компании Microgenics можно получить инструкции по применению приборов с конкретными параметрами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализатор не читает штрих-код, числовую последовательность на этикетке со штрих-кодом можно ввести вручную с помощью клавиатуры.
Контроль качества и калибровка9
Рекомендуется проводить двухточечную калибровку
• после смены емкости с реагентом
• после смены партии реагентов
• согласно требованиям процедур контроля качества
Верификация калибровки: не требуется.
Рекомендации по хорошей лабораторной практике предполагают проведение контроля качества не менее чем на двух уровнях (низкая и высокая точка) каждый день, когда анализируются образцы пациентов, и каждый раз при проведении калибровки. Отслеживайте контрольные значения на предмет каких-либо тенденций или сдвигов. В случае обнаружения каких-либо тенденций или сдвигов, или если результаты контроля не отвечают указанному диапазону, необходимо проверить все рабочие параметры. Свяжитесь со Службой технической поддержки компании Microgenics для получения дополнительной помощи и рекомендаций относительно подходящего контрольного материала.
Результаты и ожидаемые значения
Тест Фенитоин II CEDIA предназначен для количественного анализа образцов пациентов от 0.6 мкг/мл до 40 мкг/мл. Если образец показывает результат выше калибратора высокого диапазона Core TDM Multi-Cal High Calibrator (40 мкг/мл), в отчете можно либо указать > 40 мкг/мл, либо разбавить образец пациента в соотношении один к одному образцом калибратора низкого диапазона Core TDM Multi-Cal Low Calibrator и провести повторный анализ. Численный результат повторного анализа вычисляется следующим образом:
Фактическое значение = (2 х значение разведенного образца) – концентрация калибратора низкого диапазона
Если образец показывает результат менее минимально обнаруживаемой концентрации, то в отчете следует указать < 0.6 мкг/мл.
Для пересчета мкг/мл в мкмоль/л использовать следующий коэффициент пересчёта:
мкг/мл х 3.96 = мкмоль/л
мкмоль/л х 0.252 = мкг/мл
Ограничения
- Число пациентов, у которых имеются антитела к b-галактозидазе E. coli, чрезвычайно мало. Однако некоторые образцы, содержащие такие антитела, могут показать ошибочно высокие результаты, не соответствующие клиническому профилю пациента.
- Как и в любом тесте, использующем антитела мыши, существует вероятность влияния противомышиных антител человека (HAMA) в образце, что может привести к ошибочно завышенным результатам.
Ожидаемые значения
|
Терапевтический диапазон (мкг/мл) |
|
|
Взрослые |
Дети |
|
10-20 |
6-14 |
Каждая лаборатория должна исследовать применимость ожидаемых значений к своему контингенту пациентов и при необходимости определить собственный эталонный диапазон значений.
Конкретные рабочие характеристики
Ниже показаны типичные данные11, полученные на анализаторе Hitachi 911. Результаты, получаемые в вашей лаборатории, могут от них отличаться.
Воспроизводимость
Измерение воспроизводимости выполнялось анализатором Hitachi 911 на упакованных реагентах, смешанной сыворотке человека и контрольной сыворотке, с использованием руководящих указаний NCCLS по проведению модифицированных повторяющихся испытаний. Были получены следующие результаты (в мкг/мл):
|
|
Воспроизводимость в пределах прогона |
Общая воспроизводимость |
||||
|
|
Уровень 1 |
Уровень 2 |
Уровень 3 |
Уровень 1 |
Уровень 2 |
Уровень 3 |
|
N x (мкг/мл) SD (мкг/мл) CV% |
120 6,3 0,2 3,2 |
120 14,8 0,3 2,0 |
120 26,8 0,4 1,3 |
120 6,3 0,3 5,1 |
120 14,8 0,5 3,1 |
120 26,8 0,6 2,3 |
Сравнение методов
Сравнение результатов, полученных для теста Фенитоин II CEDIA (y), с результатами предыдущего теста Фенитоин CEDIA (x), дало следующую корреляцию (мкг/мл):
|
Регрессия Деминга |
Линейная регрессия |
|
|
|
Число образцов: 114
Концентрации образцов находились в диапазоне от 0.7 до 35.1 мкг/мл.
Линейность
Образец высокого диапазона был разбавлен калибратором низкого диапазона Core TDM Multi-Cal Low Calibrator. Затем был определен процент выхода путем деления значения, полученного в результате теста, на ожидаемое значение.
|
% образца с высоким содержанием |
Ожидаемое значение (мкг/мл) |
Значение, полученное в результате теста (мкг/мл) |
% выхода |
|
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 |
--- 36,58 32,57 28,56 24,55 20,53 16,52 12,51 8,50 4,49 --- |
39,57 35,87 31,80 28,37 24,63 20,67 16,53 12,60 8,47 4,40 0,23 |
--- 98,1 97,6 99,3 100,3 100,7 100,1 100,7 99,6 98,0 --- |
Выход
Фенитоин был добавлен к нормальному образцу пациента, в котором отсутствовало анализируемое вещество, и был разбавлен разными объемами образца пациента, в котором отсутствовало анализируемое вещество. Затем был определен процент выхода путем деления значения, полученного в результате теста, на ожидаемое значение.
|
% образца с высоким содержанием |
Ожидаемое значение (мкг/мл) |
Значение, полученное в результате теста (мкг/мл) |
% выхода |
|
100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 |
--- 37,46 33,24 29,01 24,79 20,57 16,34 12,12 7,90 3,67 --- |
39,93 36,57 32,73 28,87 24,87 20,63 16,30 12,30 7,90 3,53 -0,63 |
--- 97,5 98,5 99,5 100,3 100,3 99,8 101,5 100,0 96,2 --- |
Специфичность
На перекрестную реактивность в тесте Фенитоин II CEDIA были протестированы следующие соединения:
Не выявлено перекрёстного взаимодействия теста Фенитоин II CEDIA со следующими веществами:
|
Вещество |
Концентрация |
|
Билирубин Гемоглобин Триглицерид |
≤60 мг/дл ≤1000 мг/дл ≤2000 мг/дл |
Чувствительность
Минимальная концентрация, определяемая с помощью теста Фенитоин II CEDIA: 0.6 мкг/мл (2.4 мкмоль/л).