Тест «CEDIA® Тобрамицин II»

№ по каталогу: 100018 (наборы 13 х 11 мл)                                Для диагностики in vitro

Предназначение

Тест «CEDIA® Тобрамицин II» - это набор реагентов для диагностики in vitro, предназначенный для количественного определения тобрамицина в сыворотке и плазме человека.

Резюме и разъяснение теста

Тобрамицин – это аминогликозидный антибиотик, применяемый для лечения инфекций, вызванных Pseudomonas aeruginosa, Proteus species, E. coli, Klebsiella, Serratia, Citrobacter, Staphylococcus aureus, Enterobacter и другими микроорганизмами. Токсичность тобрамицина обусловлена его влиянием на синтез белка рибосомами.¹ Тобрамицин практически не подвергается метаболизму, следовательно, он выводится в виде исходного лекарства посредством клубочковой фильтрации.

Терапевтический диапазон следует измерять при пиковой и минимальной концентрациях. Измерение пиковых концентраций тобрамицина в сыворотке или плазме предлагается для обеспечения достижения адекватного противомикробного действия. Изменение минимальных концентраций обычно обеспечивает адекватное выведение лекарства и концентрации лекарства, превышающие минимальную ингибирующую концентрацию. Концентрация тобрамицина в сыворотке или плазме зависит от способа введения, объема межклеточной жидкости, продолжительности лечения и физиологических изменений во время болезни или терапии. Следовательно, мониторинг пиковых и минимальных уровней тобрамицина в сыворотке или плазме необходим для предотвращения серьезных осложнений путем корректировки вводимой дозы согласно показаниям.²

В тесте «CEDIA® Тобрамицин II» применена технология рекомбинатной ДНК (Патент США №4708929) для получения уникальной системы гомогенного иммуноферментного анализа.³

В основе теста лежит бактериальный фермент b-галактозидаза, который с помощью генной инженерии был разделен на два неактивных фрагмента, т.е. акцепторную часть фермента (EA) и донорскую часть фермента (ED). Эти фрагменты спонтанно связываются вновь, образуя действующий фермент, который в формате теста расщепляет субстрат, что приводит к изменению цвета, которое можно измерить методом спектрофотометрии.

В ходе анализа анализируемое вещество в образце конкурирует с анализируемым веществом, сопряженным с одним неактивным фрагментом b-галактозидазы, за место связывания антитела. Если в образце присутствует анализируемое вещество, оно связывается с антителом, при этом неактивные фрагменты фермента свободно сопрягаются, образуя активный фермент. Если в образце анализируемого вещества нет, антитело связывается с анализируемым веществом, сопряженным с неактивным фрагментом, подавляя повторное соединение неактивных фрагментов b-галактозидазы, при этом не происходит образования активного фермента. Количество образованного активного фермента и полученное в результате изменение абсорбции прямо пропорциональны количеству присутствующего в образце лекарства.⁵

Реагенты

1          EA буферный растворитель: содержит 3-(N-морфоллино)пропансульфоновую кислоту, буферные соли, сурфактант и консервант, (13 мл)

1а        EA реагент: содержит акцепторную часть фермента (0,22 г/л), моноклональные антитела к тобрамицину (25,5 мг/л), буферные соли, белок-носитель, стабилизатор и консервант

2          ED буферный растворитель: содержит 3-(N-морфоллино)пропансульфоновую кислоту, буферные соли, сурфактант и консервант, (11 мл)

2а        ED реагент: содержит донорскую часть фермента (23,4 мкг/л), сцепленную с тобрамицином, хлорфенол красный-b-D-галакторинанозид (2,4 г/л), антитела козы против антител мыши (3,3 г/л), буферные соли, стабилизатор и консервант

Требуемые дополнительные материалы (продаются отдельно):

Калибровочный набор CEDIA Antibiotic TDM Multi-Cal, № по каталогу 100017

Имеющиеся в продаже контрольные образцы – Относительно рекомендаций проконсультируйтесь в Службе технической поддержки клиентов

Меры предосторожности и предупреждения

Реагенты содержат азид натрия. Избегайте попадания реагентов на кожу и слизистые оболочки. Подвергшиеся воздействию участки следует промыть большим количеством воды. В случае попадания в глаза или при проглатывании необходимо немедленно обратиться к врачу. Азид натрия может вступить в реакцию с цинковой или медной сантехникой, образуя потенциально взрывоопасные азиды металлов. При утилизации таких реагентов всегда смывайте их большими количествами воды, чтобы предотвратить накопление азидов. Очищайте открытые металлические поверхности 10% гидроксидом натрия.

Приготовление и хранение реагентов

Для анализаторов фирмы Hitachi см. ниже процедуру приготовления растворов. Для всех других анализаторов смотрите инструкции по применению конкретного анализатора.

Вынимайте набор из холодильника непосредственно перед приготовлением растворов.

Чтобы максимально снизить риск возможного загрязнения, готовьте растворы в следующем порядке.

Раствор донорской части фермента R2: Соединить емкость 2а (реагент ED) и емкость 2 (буферный растворитель ED) с помощью одного из входящих в комплект переходников. Смешать содержимое, мягко переворачивая сосуды так, чтобы весь сублимат из емкости 2а оказался в емкости 2, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить емкость 2а и переходник от емкости 2 и выбросить их. Закрыть емкость 2 крышкой и дать содержимому постоять примерно в течение 5 минут при температуре 15-25°С. Снова перемешать содержимое и написать на этикетке дату разведения. Прежде чем использовать, нужно поставить бутыль непосредственно в отсек анализатора, предназначенный для реагентов, или в холодильник и дать постоять в течение 30 минут.

Раствор акцепторной части фермента R1: Соединить емкость 1а (реагент EA) и емкость 1 (буферный растворитель EA) с помощью одного из входящих в комплект переходников. Смешать содержимое, мягко переворачивая сосуды так, чтобы весь сублимат из емкости 1а оказался в емкости 1, следя за тем, чтобы не было пенообразования. Отсоединить емкость 1а от переходника и выбросить. Закрыть наполненную емкость 1 крышкой и оставить примерно на 5 минут при температуре 15-25°С. Снова перемешать содержимое и написать на этикетке дату разведения. Прежде чем использовать, нужно поставить бутыль непосредственно в отсек анализатора, предназначенный для реагентов, или в холодильник  и дать постоять в течение 30 минут.

ПРИМЕЧАНИЕ1: Входящие в этот набор компоненты предназначены для использования в комплекте. Не смешивайте компоненты из разных партий.

ПРИМЕЧАНИЕ 2: Избегайте перекрестного загрязнения реагентов, следя за тем, чтобы крышки от бутылей с реагентами совпадали с бутылями. Раствор R2 (донорская часть фермента) должен быть желто-оранжевого цвета. Красный или пурпурно-красный цвет говорит о загрязнении реагента, и его следует вылить.

ПРИМЕЧАНИЕ 3: До проведения анализа растворы R1 и R2 должны находиться при температуре отсека анализатора для реагентов. См. дополнительную информацию в инструкции по применению конкретного анализатора.

ПРИМЕЧАНИЕ 4: Для обеспечения стабильности восстановленного раствора EA, его следует защищать от продолжительного воздействия яркого света.

Храните компоненты при температуре 2-8°С. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ ИХ. Относительно стабильности неоткрытых компонентов см. срок годности на коробке или ярлыках емкостей.

Раствор R1: 30 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С.

Раствор R2: 30 дней в холодильнике анализатора или при температуре 2-8°С

Сбор и обработка образцов

Для анализа годятся образцы сыворотки или плазмы (Na или Li гепарин; Na ЭДТК). Избегайте пенообразования и повторного замораживания образца. Образцы, содержащие частицы, следует центрифугировать. Закрывайте образцы крышками, храните при температуре 2-8°С и проводите анализ в течение 1 недели. Если анализ нельзя выполнить в течение недели или если образец необходимо отправить в другое место, следует закрыть образец крышкой и держать в замороженном виде. Хранить образцы при температуре -20°С и проводить анализ в течение 4 недель. Со всеми образцами пациентов следует обращаться так, как если бы они были потенциально заразными.

Процедура анализа

Для выполнения этого анализа можно использовать биохимические анализаторы, которые позволяют поддерживать постоянную температуру, дозирование образцов пипеткой, смешивание реагентов, измерение скорости ферментативной реакции и точное определение времени реакции. В компании Microgenics имеются инструкции по применению, содержащие конкретные параметры приборов.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если анализатор не читает штрих-код, числовую последовательность на этикетке со штрих-кодом можно ввести вручную с помощью клавиатуры.

Контроль качества и калибровка⁴

Рекомендуется калибровка по 2 точкам

- после замены бутыли с реагентом

- после замены партии реагента

- согласно требованиям процедур контроля качества

Рекомендации по хорошей лабораторной практике предполагают проведение контроля качества не менее чем для двух концентраций (низкие и высокие значения) каждый день, когда анализируются образцы пациентов, и каждый раз при проведении калибровки. Отслеживайте контрольные значения на предмет каких-либо тенденций или сдвигов. В случае обнаружения каких-либо тенденций или сдвигов, или если результаты стандарта не отвечают указанному диапазону, необходимо проверить все рабочие параметры.

Результаты и ожидаемые значения

Тест «CEDIA® Тобрамицин II» предназначен для количественного анализа образцов пациентов в диапазоне от 0,24 мкг/мл до значения калибратора высокой концентрации Antibiotic TDM Multi-Cal (12 мкг/мл). Результаты анализа образцов с содержанием ниже 0,24 мкг/мл должны показываться как <0,24 мкг/мл. Результаты образцов с содержанием выше 12 мкг/мл могут быть показаны как >12 мкг/мл, или же можно развести одну часть образца одной частью калибратора низкой концентрации антибиотика Antibiotic TDM Multi-Cal и повторить анализ. Полученное после повторного анализа значение следует выводить следующим образом:

Фактическое значение = (2 х значение разведенного образцы) – концентрация калибратора низкой концентрации антибиотика Antibiotic TDM Multi-Cal

Для перевода мкг/мл в мкмоль/л используйте следующий переводной коэффициент:

                                               мкг/мл х 2,14 = мкмоль/л

                                               мкмоль/л х 0,47 = мкг/мл

Терапевтическая эффективность и эффекты токсичности тесно взаимосвязаны с концентрацией лекарства в сыворотке. У большинства взрослых пациентов пиковая терапевтическая эффективность достигается при концентрациях тобрамицина от 6-10 мкг/мл и минимальных концентрациях в диапазоне 0,5-2,0 мкг/мл. Другие исследователи сообщали также о других терапевтических диапазонах тобрамицина.^6,7

Ограничения

1. Число пациентов, у которых могут быть антитела к b-галактозидазе      E. coli, чрезвычайно      мало. Однако некоторые образцы, содержащие такие антитела, могут показать      ошибочно высокие результаты, не соответствующие клиническому профилю.
2. Канамицин А (>10%), канамицин B (>100%) и дидеоксиканамицин (>100%)      оказывают значительное влияние на результаты анализа «CEDIA® Тобрамицин II».
3. Так как в тесте используются антитела мыши,      существует вероятность интерференции противомышиных антител человека (HAMA) в образце, что      может привести к ложно повышенным результатам.

Конкретные рабочие характеристики

Ниже показаны типичные данные, получаемые на анализаторе Hitachi 704.⁸ Результаты, получаемые в Вашей лаборатории, могут от них отличаться.

Изучение воспроизводимости проводилось на контрольных образцах сыворотки и смешанной сыворотке человека с использованием анализатора Hitachi согласно руководству по модифицированному эксперименту с повторением одинаковых испытаний NCCLS. Были получены следующие:

Образец с высоким   содержанием, %	Ожидаемое значение   (мкг/мл)	Результат анализа   (мкг/мл)	Выход, %
100 75 50 25	--- 8,8 5,9 2,9	11,7 9,1 6,2 3,0	--- 103 105 103

Сравнение метода

В результате сравнения метода «CEDIA® Тобрамицин II» (y) с серийным иммунологическим анализом методом флуоресцентной поляризации (x) была получена следующая корреляция (мкг/мл):

 Линейная регрессия                                    Регрессия по Пассингу/Баблоку

                                                        

Количество измеренных образцов: 86

Концентрации в образцах составляли от 0,31 до 11,59 мкг/мл

Линейность

Образец с высокой концентрацией разводился калибратором низкой концентрации антибиотика TDM. Затем определялся процент выхода путем деления значения, полученного в результате анализа, на ожидаемое значение.

	Воспроизводимость в   пределах одного анализа			Общая   воспроизводимость
n x (мкг/мл) SD (мкг/мл) CV%	120 1,8 0,12 6,7	120 4,8 0,16 3,4	120 8,9 0,21 2,3	120 1,8 0,13 7,3	120 4,8 0,20 4,1	120 8,9 0,31 3,4

 Выход

 Тобрамицин в форме образца от пациента с высокой концентрацией (с добавлением известного количества искомого вещества) добавлялась в образец от пациента с низкой концентрацией. После чего определялся процент выхода путем деления полученного в результате анализа значения на ожидаемое значение.

Образец с высоким   содержанием, %	Ожидаемое значение   (мкг/мл)	Результат анализа   (мкг/мл)	Выход, %
100 75 50 25	--- 7,6 5,1 2,6	10,1 7,7 5,1 2,5	--- 101 100 96

Специфичность

Тест «CEDIA® Тобрамицин II» является очень специфичным, у него очень низкая перекрестная реактивность с веществами со сходной структурой или одновременно вводимыми лекарствами. Для следующих соединений перекрестная реактивность является клинически незначимой (<0,3%).

Не было обнаружено влияния следующих веществ на анализ «CEDIA® Тобрамицин II»:

Вещество	Концентрация
Билирубин Гемоглобин IgA IgG IgM Ревматоидные факторы Общий белок Триглицериды	60 мг/дл 1000 мг/дл 2700 мг/дл 4900 мг/дл 900 мг/дл 1200 МЕ/мл 13,2 г/дл 1000 мг/дл

Чувствительность

Минимальная определяемая концентрация для анализа «CEDIA® Тобрамицин II» составляет 0,24 мкг/мл (0,51 мкмоль/л).